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dc.contributor.advisorSygusch, Jurgen
dc.contributor.authorTalbot, Guylaine
dc.date.accessioned2018-10-16T16:03:17Z
dc.date.available2018-10-16T16:03:17Z
dc.date.created1995
dc.date.issued1995
dc.identifier.isbn0612045455
dc.identifier.urihttp://hdl.handle.net/11143/13736
dc.description.abstractQuatre hémicellulases, une mannanase, une xylanase, une galactosidase et une xylosidase, ont été produites chez la bactérie thermophile Bacillus stearothermophilus en incubant le bacille dans un milieu minimal liquide dont l'hémicellulose appropriée, soit la gomme de caroube ou la xylane, a été utilisée comme source de carbone. Les hémicellulases ont été produites en phase poststationnaire. La production maximale d'activité de la mannanase est de deux jours, de six jours pour celle de la galactosidase et de cinq jours pour celle des xylanase et xylosidase. Les quatre activités retrouvées dans le milieu de culture ont été purifiées à homogénéité. Les étapes de purification ont fait appel à des techniques de chromatographie à échange d'ions et à interactions hydrophobes, de chromatofocalisation et de filtration sur gel. La mannanase a une activité spécifique de 100 U/mg. Sa masse moléculaire est de 73 kdaltons et elle est dimérique (162 kdaltons). La galactosidase a une activité spécifique est de 160 U/mg et a une masse moléculaire apparente de 82 kdaltons. Sa migration sur gel de polyacrylamide sous conditions non réductrices et non dénaturantes montre qu'elle est formée de trois sous-unités. La xylanase a une activité spécifique de 250 U/mg et a une masse moléculaire de 41 kdaltons. La xylosidase a une activité spécifique de 30 U/mg et une masse moléculaire de 75 kdaltons. La mannanase et la galactosidase ont été caractérisées. Le pH optimal de ces protéines est de 7 à 7.5. La thermostabilité des protéines purifiées a aussi été testée. La mannanase est stable durant au moins 24 heures à 65°C et perd moins de 10% d'activité à 70°C pour la même période de temps. La galactosidase est stable pendant 24 heures à 60°C et perd environ 30% d'activité à 65°C. La mannanase a une vitesse maximale (Vmax) de 455 U/mg et une constante de Michaelis (Km) de 1.5 mg/ml envers la gomme de caroube. La galactosidase a un Vmax de 195 U/mg et un Km, de 0.25 mM envers le p-nitrophényl ?-D-galactopyranoside. Leur spécificité est strictement reliée à leur activité particulière. Le clonage des quatre hémicellulases a été effectué en criblant deux bibliothèques d'ADN génomique de B. stearothermophilus, dont le site de clonage est EcoRI ou Hind III, clonées dans E. coli DH5?MCR. Le criblage s'est fait en détectant l'activité recherchée sur des boîtes de pétris contenant un substrat chromogénique. La taille des clones a été analysée ainsi que la sécrétion de protéines recombinantes par les bactéries transformées. L'analyse de la taille des protéines recombinantes par des zymogrammes a permis de déterminer qu'elles sont toutes de la taille qui correspond à leur homologue purifiée de B. stearothermophilus. Le taux d'expression a aussi été mesuré. La galactosidase et la xylosidase sont nettement surexprimées puisque dix fois plus d'activité est exprimée que dans la bactérie d'origine B. stearothermophilus. Le séquençage d'un ADN cloné dans pBR322 et obtenu par criblage d'une bibliothèque d'ADN de B. megaterium avec des oligonucléotides déduits de la séquence N-terminale de la chitosanase purifiée dans notre laboratoire a été complété. Une étude de similarité de cette séquence avec des banques de séquences (GenBank) a permis d'identifier une homologie de 84% au niveau des acides aminés avec une cellulase de Bacillus sp. KSM-330. Cette homologie se retrouve strictement au niveau des acides aminés faisant partie de la protéine mature. Les 49 premiers acides aminés constituant le peptide signal de sécrétion sont spécifiques à ce clone et la séquence d'ADN correspondante se retrouve également au niveau de l'ADN génomique, tel que démontré par amplification in vitro de la région en question.
dc.language.isofre
dc.publisherUniversité de Sherbrooke
dc.rights©Guylaine Talbot
dc.titlePurification, caractérisation et clonage d'hémicellulases thermostables de la bactérie bacillus stearothermophilus
dc.typeThèse
tme.degree.disciplineBiochimie
tme.degree.grantorFaculté de médecine et des sciences de la santé
tme.degree.levelDoctorat
tme.degree.namePh.D.


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