Identification, solubilisation et purification d'une ATP diphosphohydrolase chez le pancréas de porc

Abstract

Le calcium joue un rôle important dans le transport des zymogènes pancréatiques et dans le couplage entre la stimulation et la sécrétion de la cellule acineuse pancréatique. En cherchant à purifier la Ca 2 +-ATPase responsable des mouvements intracellulaires du calcium, nous avons identifié dans le pancréas de porc, une ATP diphosphohydrolase ca 2 +-dépendante. Cette activité est associée à une fraction microsomale légère. La caractérisation de la réaction enzymatique a été en grande partie réalisée en mesurant le phosphore libéré. Pour ce faire, nous avons mis au point une nouvelle méthode qui s'est avérée tout à fait adéquate pour nos besoins. Le pH optimum est de 8.5 pour l'hydrolyse des nucléosides tri- et diphosphate qui sont les substrats spécifiques. Des Km respectifs de 7.3 et 7.4 x 10- 6 M ont été trouvés pour l'ATP et l'ADP. De plus, on a démontré qu'une seule protéine hydro­ lyse l'ATP et l'ADP. L'enzyme étant une protéine mernbranaire intrinsèque, un détergent (Triton X-100) a dû être utilisé pour la solubiliser et en poursuivre la purification. La chromatographie successive sur Sépharose 4B et sur Affi Gel Bleu a permis d'obtenir une préparation enzymatique 270 fois plus active que l'homogénat. La protéine majeure de cette préparation possède un poids moléculaire de 65,000 daltons et est identique aux bandes manifestant les activités d'hydrolyse d'ATP et d'ADP, et isolées par électrophorèse. L'activité enzymatique étant liée spécifiquement sur une colonne de ConA-Sépharose, l'enzyme doit donc être considéré comme une glycoprotéine. Cet enzyme pourrait être impliqué dans les mouvements intracellulaires de calcium du pancréas exocrine et y jouerait vraisemblablement un rôle clé dans le contrôle de la concentration cytosolique de ce dernier.