Évaluation de la performance du qPCR pour le dénombrement de bactéries dans le milieu pharmaceutique

Abstract

La finalité du projet de recherche est de réduire le délai existant entre l’échantillonnage microbiologique des matières pharmaceutiques et le temps d’obtention du résultat des analyses; c'est-à-dire réduire le temps de cycle des tests microbiologiques. Concrètement, le projet de recherche vise à éliminer le temps d'attente du test de dénombrement des bactéries; ce temps est de 5 jours dus à l'incubation des microorganismes. Le temps de cycle des analyses microbiologiques est le goulot d’étranglement de la relâche de quarantaine des équipements et des matières premières. De plus, la découverte de contaminations se fait avec un temps de retard sur l’apparition de la contamination ce qui entraine des pertes de produits et au final des coûts pour une usine qui relâche ses équipements de la quarantaine avant l'obtention du résultat. L’objectif du projet de recherche est d’évaluer la performance d’une méthode qPCR pour réaliser le dénombrement de bactéries dans le milieu pharmaceutique. La démarche consiste à évaluer la technologie selon les critères des instances réglementaires pharmaceutiques (limite de détection, précision, linéarité, robustesse, spécificité, etc.) et selon le principe d’équivalence avec la méthode traditionnelle. Les présents travaux de recherche permettent d'évaluer le potentiel de la méthode à être validée pour l’implantation dans une usine pharmaceutique. Les paramètres suivants ont aussi été évalués pour connaitre leur influence sur la quantification et/ou leur relation avec la méthode traditionnelle : effet de l'état de croissance des cellules, effet de l'algorithme de quantification et effet des bactéries totales indépendamment de leur état de viabilité. Le projet de recherche a démontré que la méthode de q-PCR avait le potentiel d'être validée en utilisant les critères pharmaceutiques en soulevant certains obstacles qui risquent de rendre la validation difficile. Le principal obstacle est le rapport variable entre le résultat de quantification par qPCR et celui de la méthode traditionnel. Cet obstacle peut être surmonté à condition d'avoir préalablement validé une méthode de préparation de cellules qui permet d'obtenir un rapport stable entre les unités de quantification de la méthode traditionnelle et de la méthode de qPCR. Il a été démontré que la préparation de cellules et son effet sur l'état de croissance de celles-ci sont à l'origine de ces variations. La gamme de produits apte à être traitée par la méthode de qPCR comprend les tests d'eau purifiée et les tests de liquides filtrables. La gamme de matières pouvant être analysée par la méthode de qPCR pourrait potentiellement être élargie à condition d'élargir nos connaissances sur l'effet des bactéries mortes et des bactéries viables non cultivables sur le contrôle microbiologique pharmaceutique. De plus, la gamme de matière traitée par la méthode pourrait être élargie avec le développement d'une méthodologie spécifique à la préparation de ces matières. L'étude a aussi démontrée que l'algorithme utilisé pour la quantification avait un effet important sur la précision, l'erreur, le biais et la robustesse. Un algorithme qui augmente spécifiquement la robustesse, de la méthode a été développé. Les conclusions de l'étude ne sont pas spécifiques au domaine pharmaceutique et peuvent s'étendre à d'autres domaines concernés par l’analyse microbiologique tel que l'alimentaire et les biotechnologies.