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dc.contributor.advisorGroleau, Denis
dc.contributor.authorAkassou, Mouniafr
dc.date.accessioned2018-05-18T12:55:59Z
dc.date.available2018-05-18T12:55:59Z
dc.date.created2018fr
dc.date.issued2018-05-18
dc.identifier.urihttp://hdl.handle.net/11143/12246
dc.description.abstractLe besoin de développement d’amylases thermostables, principalement de pullulanases, s’est accru ces dernières décennies dû à l’importance de ces enzymes dans plusieurs bio-industries. Ce présent projet de recherche s’inscrit dans le cadre général du développement industriel de la production extracellulaire d’une pullulanase thermostable. Une revue bibliographique sur les avancées technologiques et les défis à relever pour la production extracellulaire de pullulanases thermostables a été réalisée. Cette revue de littérature expose une problématique liée à la production des pullulanases par divers hôtes d’origine et par le biais de production recombinante en utilisant des cellules hôtes comme E. coli, B. subtilis et P. pastoris. Cette problématique se résume dans la difficulté de produire de façon extracellulaire des pullulanases thermostables à haute activité enzymatique, ce qui engendre l’utilisation de plusieurs méthodes de purification coûteuses et souvent difficilement applicables à l’échelle industrielle. La modification structurale de ces enzymes via différentes techniques de protein engineering a permis le développement de pullullanases hautement thermostables et/ou ayant une activité catalytique remarquable. Cependant, ces techniques sont coûteuses et nécessitent le développement d’outils de bioinformatique plus efficaces afin de mieux maîtriser le processus de modification. Une étude expérimentale fut réalisée afin d’évaluer la capacité de Thermus thermophilus HB8 à accumuler de façon extracellulaire des enzymes amylolytiques, principalement de pullulanase. Les tests de production initiaux ont indiqué clairement que seulement de très faibles niveaux d'activité amylolytique pouvaient être détectés, à partir d’extraits cellulaires en utilisant le détergent doux non ionique Triton X-100 (TX100). Une stratégie d'optimisation séquentielle, basée sur des techniques statistiques, a été utilisée pour améliorer la production d'activité amylolytique extracellulaire afin d'obtenir des niveaux d’activité industriellement attrayants. L'accent a été mis sur le niveau optimal de la concentration initiale de la biomasse, la composition du milieu de culture et la température pour maximiser l'accumulation d'enzymes amylolytiques. Suite à de tels efforts, l'accumulation d'enzymes amylolytiques extracellulaires a été augmentée de plus de 70 fois, avec des niveaux d’activité de 76 U/mL. La préparation brute d'enzyme extracellulaire a été partiellement caractérisée. Les valeurs optimales de température et de pH ont été trouvées, respectivement, 80°C et 9,0. 100% de l'activité enzymatique initiale a pu être maintenu après 24 h d'incubation à 80°C, ce qui prouve la thermostabilité très élevée de la préparation enzymatique. Une autre étude sur la capacité de Pichia pastoris de produire de façon extracellulaire la pullulanase type 1 de Thermus thermophilus HB8 fut réalisée. Les effets de différents paramètres sur la production extracellulaire de la pullulanase ont été déterminés, à savoir les séquences peptides-signal de sécrétion (SP), la présence de Triton X-100 (TX100) à différentes concentrations et à différents temps d'addition, la présence de différents osmolytes naturels, le pH, la température et la source de carbone. La production de pullulanase extracellulaire a augmenté de plus de 40 fois en ajoutant de l'acide K-glutamique (0,40% (p/v)) avant 5 h d'induction, et du TX100 (2% (v/v)) après 48 h d'induction, et suivi d’une incubation de 24 h à 30°C et à pH de 8,0. Aussi les profils d’activité enzymatique de la pullulanase recombinante en fonction du pH et de la température furent établis. La température et le pH optimaux de l'activité pullulanase étaient respectivement, 70°C et 6,0. La préparation enzymatique a maintenu 50% de son activité catalytique après une incubation à 70°C pendant plus de 120 min.fr
dc.language.isofrefr
dc.language.isoengfr
dc.publisherUniversité de Sherbrookefr
dc.rights© Mounia Akassoufr
dc.rightsAttribution - Partage dans les Mêmes Conditions 2.5 Canada*
dc.rightsAttribution - Pas d’Utilisation Commerciale - Partage dans les Mêmes Conditions 2.5 Canada*
dc.rights.urihttp://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/2.5/ca/*
dc.subjectPullulanasefr
dc.subjectAmylasefr
dc.subjectThermus thermophilus HB8fr
dc.subjectPichia pastorisfr
dc.subjectOptimisationfr
dc.subjectSécrétionfr
dc.subjectTriton X-100fr
dc.subjectOsmolytes naturelsfr
dc.subjectThermostabilitéfr
dc.titleProduction d’une activité amylolytique thermostable par Thermus thermophilus HB8 suivie du clonage et de l’expression d’une pullulanase de type 1 de T. thermophilus HB8 chez la levure méthylotrophe Pichia pastorisfr
dc.typeThèsefr
tme.degree.disciplineGénie chimiquefr
tme.degree.grantorFaculté de géniefr
tme.degree.levelDoctoratfr
tme.degree.namePh.D.fr


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