Caractérisation immunologique et moléculaire de systèmes autoimmuns associés à la polyarthrite rhumatoïde

Abstract

La polyarthrite rhumatoïde (PR) est une maladie inflammatoires articulaire, dans laquelle la réponse autoimmune humorale semble importante pour le diagnostic de la maladie. Cette étude consiste à identifier de nouveaux autoantigènes et à caractériser leur implication possible dans la pathogénèse de la PR. En utilisant des extraits de rate (ERH) ou de placenta humains (EPH) semi-purifiés sur DEAE, des sérums de patients rhumatoïdes analysés en immunobuvardage ont identifié un nouveau système autoimmun (Sa/anti-Sa). Les sérums de 482 individus normaux ou souffrant de maladies rhumatismales diverses ont été testés en immunobuvardage afin de définir la spécificité des anticorps anti-Sa dans la PR. Les sérums de 42.7% (88/206) des patients rhumatoïdes ont détecté l'antigène Sa de 50 kD, incluant 29% (9/31) des patients en phase précoce de la maladie et 27% (17/63) des patients rhumatoïdes négatifs pour le facteur rhumatoïde. Les anticorps anti-Sa ont essentiellement été détectés dans les sérums de patients rhumatoïdes, avec une spécificité de 98.9%. Le système Sa est distinct des autres autoantigènes associés à la PR. Ceux-ci incluent le FR, les antigènes codés par le virus Epstein-Barr, le RA33, les composantes du cartilage articulaire, les protéines de stress bactériennes ou humaines et la filaggrine. Les autoanticorps anti-Sa sont principalement d'isotype IgG et ont révélé des titres variant entre 1/50 et 1/1000. Alors que l'antigène Sa est indétectable dans des extraits bruts de divers lignées cellulaires, il est présent dans des tissus humains normaux, tels que la rate et le placenta, et particulièrement concentré dans le tissu synovial rhumatoïde. Des expériences de réactivité croisée avec des anticorps purifiés ont montré que l'antigène Sa possède des épitopes communs entre ces trois extraits tissulaires. Les anticorps anti-Sa sont également présents dans les liquides synoviaux prélevés de patients rhumatoïdes anti-Sa positifs. L'analyse de sérums sériés de quelques patients a montré que le titre des anticorps anti-Sa varie avec l'activité de la maladie. À la suite de la purification de l'EPH par chromatographie d'échange d'ions en gradient sur HPLC, l'antigène Sa élue à 240 mM de NaCl et trois bandes polypeptidiques non glycosylées de 53, 50 et 49 kD ont été obtenues par SDS-PAGE. Des déterminants antigéniques identiques entre chacune des bandes polypeptidiques ont été observés à l'aide d'anticorps purifiés, suggérant une dégradation protéolytique aucours de l'extraction et de la purification ou un partage antigénique entre des protéines de poids moléculaires distincts. Le microséquençage des bandes de 50 et 49 kD a révélé une homologie de 62.5% sur 16 résidus d'acides aminés avec la vimentine humaine. Des expériences comparatives ont démontrées que la vimentine n'est pas identique à l'antigène Sa. Premièrement, la vimentine purifiée n'est pas reconnue par la plupart des sérums anti-Sa positifs. Deuxièmement, aucun partage antigénique n'a été observé à la suite d'absorptions croisées de sérums anti-Sa ou anti-vimentine positifs avec l'antigène Sa placentaire et la vimentine purifiée. Le microséquençage de la bande polypeptidique de 53 kD a démontré une homologie parfaite sur 20 résidus d'acides aminés avec la sous-unité ? de la prolyl 4-hydroxylase, connue aussi sous le nom de protéine disulfure isomérase (PDI). L'ADNc de la PDI isolé par réaction en chaîne de polymérase a été sous-cloné dans le vecteur d'expression pGEX-KG afin d'analyser l'immunoréactivité de sérums anti-Sa avec la protéine recombinante (PDIr). Plusieurs sérums rhumatoïdes et non-rhumatoïdes ont détectés la PDIr en immunobuvardage. De plus, des absorptions de sérums avec la PDIr n'ont pas inhibé la réactivité contre l'antigène Sa, suggérant l'absence d'un partage antigéniques entre l'antigène Sa et la PDIr. Malgré sa non-spécificité, la réponse autoimmune contre la PDIr fera l'objet d'études ultérieures. En criblant une librairie d'expression de placenta humain dans le vecteur ?gt11 avec un pool de sérums rhumatoïdes pré-sélectionnés selon des critères stricts de sérologie autoimmune, nous avons identifié et cloné un ADNc (RA-1) codant pour une portion de la calpastatine humaine. La calpastatine est l'inhibiteur naturel des calpaïnes, des protéinases à cystéine activées par le Ca++. Les calpaïnes sont impliquées d'une part dans la transmission de signaux intracellulaires et d'autre part dans la destruction du tissu conjonctif et de la matrice du cartilage articulaire. Le fragment cloné est de 950 pb et code pour un polypeptide recombinant de 284 acides aminés, avec un poids moléculaire de 35.9 kD. La séquence nucléotidique du clone RA-1 s'est avérée entièrement homologue à l'ADNc codant pour deux domaines en COOH-terminal de la calpastatine humaine. Chacun des deux domaines codés par RA-1 contient une séquence consensus associée à l'activité inhibitrice de la calpastatine. L'ADNc du clone RA-1 a ensuite été sous-cloné dans un système d'expression procaryote, en utilisant le vecteur pGEX-4T-1 qui code pour la glutathione S-transférase comme protéine porteuse et pour un site de clivage par la thrombine afin d'isoler la protéine recombinante (RA-1r). L'analyse en immunobuvardage de sérums rhumatoïdes et témoins révèle que 21/44 (45.5%) des sérums de PR détectent spécifiquement la protéine RA-1r, contrairement à 2/43 (4.7%) des sérums de patients témoins non rhumatoïdes et aucun de 10 individus normaux. En conclusion, nous avons identifié et caractérisé deux nouveaux marqueurs spécifiquement associés à la PR, l'antigène Sa et la calpastatine, et nous avons étudié deux autres marqueurs non spécifiques, la PDI et la vimentine. L'antigène Sa représente un marqueur diagnostique potentiel pour la PR. Sa nature moléculaire et son rôle potentiel dans la pathogénèse de la maladie inflammatoire articulaire chronique mérite d'être exploré plus en profondeur. D'autre part, les autoanticorps anti-calpastatine peuvent également agir comme marqueur spécifique dans les formes érosives d'arthrites chroniques. La réponse de patients rhumatoïdes contre la calpastatine suggère une implication pathogénique possible des autoanticorps anti-calpastatine, via la formation de complexes immuns au site même de l'inflammation ou via un mécanisme d'interférence immune en bloquant le pouvoir inhibiteur de la calpastatine sur les calpaïnes. Des expériences de liaison et d'inhibition in vitro, devront faire l'objet d'études futures afin de confirmer cette hypothèse. Les protocoles d'absorptions croisées entre les antigène Sa et calpastatine suggèrent que ces deux autoantigènes sont distincts du point de vue moléculaire mais semblent partager des déterminants antigéniques communs. L'évaluation prospective de la réponse autoimmune dirigée contre l'antigène Sa et contre la calpastatine devrait être étudiée afin de faire valoir davantage leurs potentiels diagnostiques et/ou pronostiques dans la PR.