Implication des différents réservoirs calciques et résistance aux agents cytostatiques par l'expression de la P-glycoprotéine chez les lymphocytes Jurkat E.6.1

Abstract

Plusieurs substances connues pour leur propriété d'induire l'arrêt du cycle cellulaire ont été utilisées afin de synchroniser les lymphocytes Jurkat E.6.1 dans le but d'étudier l'implication et l'importance des différentes phases du cycle dans le processus d'activation. Ces substances peuvent être regroupées selon leur site d'action: celles qui arrêtent les cellules en phase G1/S (hydroxyurée, lovastatine, thymidine), celles qui arrêtent les cellules en phase S précoce (aphidicoline, cyclosporine A, rapamycine) et celles qui arrêtent les cellules en phase G2/M (colchicine, cytochalasine B, nocodazole, taxol, vinblastine). Les analyses de cytofluorimétrie ont montré que les cellules Jurkat se distribuent à 45± 7% en phase G1, 43± 8% en phase S et 13± 3% en phase G2/M. Les résultats montrent qu'une synchronisation partielle est obtenue suite à l'utilisation des drogues. La distribution cellulaire est d'environ 25-40% en phase G1, 35-50% en phase S et 5-18% en phase G2/M lorsque l'hydroxyurée (100mM) et la lovastatine (100/µM) sont utilisées. La thymidine n'a pas d'effet. Lorsque des drogues bloquant en phase S sont utilisées, seule l'aphidicoline (15µM) permet un enrichissement à 65% dans cette phase, diminuant à 30% la phase G1 sans changer la distribution de la phase G2/M. Par contre, l'utilisation de cyclosporine A (100nM) et de rapamycine (20nM) augmentent le pourcentage de cellule en phase G1 (60-70%) plutôt que la phase S (20-30%), ce qui a eu comme conséquence la diminution des cellules en phase G2/M (10% et moins). De leur côté, les agents destabilisateurs du cytosquelette ont enrichi la distribution cellulaire en phase G2/M (30-50%). Les études de calcium sur des populations partiellement synchronisées montrent l'implication importante du calcium dans les premières phases du cycle cellulaire. L'effet de la colchicine (10µM) sur la morphologie cellulaire à été étudié par microscopie électronique à balayage. Seulement après 1 heure de traitement, les lymphocytes Jurkat E.6.1 subissent une désorganisation de la membrane plasmique, un phénomène absent chez les cellules Jurkat témoins. Cet effet est temporaire puisqu'après 24 heures de traitement avec la colchicine, les cellules retrouvent leur morphologie originale. L'impossibilité de synchroniser les lymphocytes Jurkat E.6.1 et les études de microscopie électronique, sous-entendent un mécanisme de résistance des lymphocytes Jurkat aux agents xénobiotiques. Nous avons alors émis l'hypothèse que la résistance soit due à l'expression d'une P-glycoprotéine, codée par les gènes MDR. Des études d'influx et d'efflux de vinblastine tritiée ont montré une cinétique appuyant l'hypothèse et des analyses de type Northern ont montré un ARN messager de 4.5kb, en accord avec la taille de l'ARN messager de la P-glycoprotéine. L'augmentation de la concentration cytosolique de calcium est essentielle à l'activation des lymphocytes T. Cette augmentation est causée d'une part par le relâchement de calcium des réserves internes et d'autres part, par l'influx de calcium qui se fait probablement via des canaux calciques. Suite à des résultats préliminaires, nous avons émis l'hypothèse de la présence de deux réservoirs calciques impliqués dans la mobilisation du calcium chez les cellules Jurkat E.6.1. Les résultats obtenus suggèrent la présence de deux réservoirs calciques dont un est sensible à l'IP3 et l'autre sensible au calcium, à la caféine et à la ryanodine. Par contre, la relation fonctionnelle entre ces réservoirs n'a pu être établie. Suite à ces résultats, la mise en évidence d'un récepteur à la ryanodine a été tentée par des études de type Western mais sans succès.