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dc.contributor.advisor[non identifié]
dc.contributor.authorDalpé, Gratien
dc.date.accessioned2018-04-06T20:03:00Z
dc.date.available2018-04-06T20:03:00Z
dc.date.created1993
dc.date.issued1993
dc.identifier.isbn031598693X
dc.identifier.urihttp://hdl.handle.net/11143/12060
dc.description.abstractLes cANCAs sont des autoanticorps qui ciblent une protéase à sérine des neutrophiles et des monocytes. Les analyses de séquences N-terminales de l'autoantigène publiées à ce jour, identifient une nouvelle protéase à sérine nommée la myéloblastine. Un premier objectif de mon travail de maîtrise est de confirmer la présence d'autoanticorps ciblant la myéloblastine dans le sérum de patients atteints de la granulomatose de Wegener. Un deuxième objectif est de proposer un modèle d'interaction entre les cANCAs et leur autoantigène; nous voulons vérifier si l'antigène est exprimé à la surface des neutrophiles et des monocytes. Un troisième objectif est de définir un domaine de l'antigène ciblé par les cANCAs, afin d'évaluer l'antigénicité des différentes parties de la protéine. Nous avons débuté par la détection de l'antigène dans une lignée cellulaire comme les cellules HL60 ainsi que dans les neutrophiles et les cellules mononucléées du sang périphérique. Nous sommes parvenu à détecter l'antigène par la technique d'immunoprécipitation à l'aide d'anticorps provenant de sera cANCAs de patients et de protéines cellulaires liées à un ligand de protéase radiomarqué. Cette méthode très sensible nous a été très utile pour détecter de nombreux sera à hauts titres avec des anticorps dirigés contre une protéase à sérine 29 kD et sur une forme mineure de 47 kD nouvellement observée. La protéine immunoprécipitée a un poids moléculaire de 29 kD comme initialement décrit, mais nous avons observé une nouvelle forme de 47 kD. Cette nouvelle forme ne peut être uniquement due à une modification post-traductionnelle, tel que démontré par les travaux publiés sur le clonage du gène de la myéloblastine. L'immunoprécipitation de protéines de cellules HL60 radiomarquées au 32P-orthophosphate a permis de démontrer que la forme de 47 kD contient du phosphate, ainsi que celle de 29 kD. La séquence primaire de la myéloblastine ne contient pas de motifs connus de phosphorylation dans les cellules eucaryotes, nous suggérant que le phosphate est ajouté en bloc avec une autre composante. Cette protéase n'a pas de motif de liaison pour des acides nucléiques, et est emprisonnée dans les granules, suggérant que le phosphate est ajouté à la protéine, dès sa synthèse dans le réticulum endoplasmique. Nous avons aussi démontré par la technique de cytofluorométrie que l'antigène est exprimé à la surface membranaire des neutrophiles et des cellules HL60, en plus d'être présente sous forme libre dans les granules. Des inducteurs de dégranulation comme le TNF? et le PMA augmentent l'expression de surface de la myéloblastine dans les cellules HL60. Ces deux agents activent la dégranulation de ces cellules, impliquant que l'augmentation de l'expression membranaire de la myéloblastine est due à la fusion des membranes de granules avec la membrane plasmique. Ceci suggère qu'une partie de la myéloblastine est ancrée dans une membrane dès sa synthèse dans le réticulum endoplasmique. La séquence de l'ADNc de la myéloblastine n'a pas de séquences transmembranaires prédites pouvant permettre son ancrage dans la membrane. Donc, nous croyons que cette protéine doit subir une modification qui lui permet d'être liée à la membrane cytoplasmique. Les résultats présentés dans ce mémoire ne permettent pas d'affirmer quelle est cette modification. Cependant, nous suggérons que cette modification permet la liaison à la membranne plasmique. Parmi les hypothèse à envisager, il y a la modification du messager par épissage alternatif: de nouveaux exons pourraient substituer des exons déjà connus ou être ajoutés sur le transcrit primaire. La traduction de ces exons expliquerait la différence de poids moléculaire. Il y a aussi l'hypothèse voulant que la protéine soit modifiée de façon post-traductionnelle. Ainsi, la Mbn pourrait s'associer de façon covalente à une protéine transmembranaire. Aussi, la protéine pourrait être modifiée pour permettre la liaison à la membrane. Il a été décrit que des protéines peuvent être modifiées de façon post-traductionnelle par l'ajout en bloc, au niveau de réticulum endoplasmique, d'un groupement glycosyl-phosphatidylinositol (GPI). L'ajout d'un groupement GPI expliquerait la liaison à la membrane et la présence de phosphate sur la Mbn. Toutefois, il reste à démontrer que l'ajout d'un groupement GPI puisse modifier le poids moléculaire pour donner une forme de 47 kD. Nous avons également démontré que le PMA induit une diminution de la forme membranaire chez le neutrophile seulement. Le PMA génère également une forme de 47 kD extracellulaire (dans le surnageant des cellules) chez les neutrophiles. Ces données suggèrent qu'il existe un lien entre la forme de 47 kD et la forme membranaire de Mbn: la forme de 47 kD serait libérée de la membrane. Aussi ce phénomène peut être inhibé, car des neutrophiles traités avec une phospholipase D (PLD) exogène ne peuvent plus générer une forme p47 kD, induite normalement par le PMA. Nous n'avons pas encore déterminé si l'inhibition par la PLD est due à un effet pharmacologique sur les neutrophiles ou directement sur la myéloblastine membranaire. Nous avons également voulu déterminer quel type d'épitope est reconnu par un sérum cANCA typique. Nous avons déterminé qu'un des sera cANCA peut immunoprécipiter des déterminants linéaires, y compris des petits polypeptides de la myéloblastine de 12 et de 7.5 kD liés au 3H-DFP. Sachant que le site de liaison du DFP est situé sur la sérine catalytique, ceci nous indique que ce sérum contient des IgGs dirigées contre la partie carboxy terminale de la protéine. De plus, ce sérum est capable d'immunoprécipiter une phosphoprotéine de 15 kD, induite par le mannitol chez la bactérie Staphylococcus aureus. Cette immunoprécipitation peut être inhibée en fonction de la quantité de protéines de granules primaires des cellules HL60 préincubées avec le sérum. Ce sérum ayant des anticorps monospécifiques contre la myéloblastine, nous concluons que les cANCAs ont une réaction croisée avec cette phosphoprotéine, que l'on croit être le produit du gène EIIAmtl de S.aureus. La séquence publiée de cette protéine contient un motif de phosphorylation sur les histidines parfaitement conservé sur la séquence primaire de la myéloblastine (près du site de liaison au DFP), supportant l'hypothèse que les anticorps anti-myéloblastine (cANCA) pourraient être produits d'abord pour se défendre contre une infection de S.aureus, et par mimétisme moléculaire contre une protéine "soi": la myéloblastine. De plus, la myéloblastine est la seule protéine eucaryote (dans la banque de séquences EMBL) à posséder ce motif de phosphorylation, ce qui pourrait représenter un mécanisme d'autoimmunisation très spécifique. Ce mécanisme autoimmun serait un moyen possible de contourner la tolérance immunitaire et pourrait expliquer, compte tenu du rôle pathogénique possible de ces autoanticorps, l'importance déjà connue des infections bactériennes dans la granulomatose de Wegener.
dc.language.isofre
dc.publisherUniversité de Sherbrooke
dc.rights© Gratien Dalpé
dc.titleIdentification et caractérisation de l'autoantigène des cANCAs : la myéloblastine
dc.typeMémoire
tme.degree.disciplineBiochimie
tme.degree.grantorFaculté de médecine et des sciences de la santé
tme.degree.levelMaîtrise
tme.degree.nameM. Sc.


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