Caractérisation des cytochromes P450c11 et P450c18 chez le hamster

Abstract

Lors de l'étude du P450c18 de hamsters sous-diète faible en sodium, une analyse par buvardage de type Northern, à partir de surrénale, a permis de révéler trois bandes à 2 kb, 2.3 kb et 3.4 kb respectivement à l'aide d'une sonde spécifique au P450c18. Ces trois formes d'ADNc ont été recherchées dans une banque d'ADNc de surrénale de hamster. Deux clones différents ont été isolés codant pour le P450c18 (clone 18 et clone 5) et deux codant pour le P450c11 (clone 43 et clone ?1). La comparaison de la région codante du P450c11 clone ?1 avec le P450c18 clone 18 montre une homologie de 90% entre les séquences en acide nucléique et de 84% pour les séquences en acide aminé. Le clone 43 contient 2079 nucléotides et possède une région codante de 1500 pb. Ce clone possède deux nucléotides différents par rapport au clone ?1, changeant les acides aminés Ala29 du clone ?1? Ser29 et Ala178? Val178. Le clone 18 possède 1925 pb ayant une région codante de 1503 pb. Une particularité du clone 18 est la présence des séquences promotrices AD1, AD2 ainsi qu’une boîte TATA dans la région 5' non-codante de l'ADNc. Le clone 5 possède 2361 pb et à la position +27 du codon d'initiation du clone 18, la séquence diffère de celle du clone 18 et ne possède pas de codon d'initiation dans le cadre de lecture de la protéine. Deux acides aminés diffèrent également entre le clone 18 et le clone 5, Leu144 clone 18 ? Ile144 et Ala326 clone 18 ? Thr326. Utilisant la technique du PCR RACE, le début de la transcription du clone 43 a pu être situé à -12 pb du codon d'initiation. Pour le P450c18 le PCR RACE a permis d'identifier une forme d'ADNc plus courte que celles retrouvées par criblage d'une banque d'ADNc. Ce P450c18 (clone 3) possède un début de transcription situé entre -11 et -12 pb de l'ATG. Trois constructions des ADNc de P450c18 de hamster ont été réalisées dans le vecteur d'expression pSV-SPORT 1. La construction 4.1 représente l'ADNc du clone 18 (construction 2.1) mais en l’absence de la séquence promotrice et la construction 6,2 par une substitution des acides aminés Leu144 ? Ile144 et Ala326 ? Thr326. Deux constructions des ADNc de P450c11 de hamster ont également été réalisées. La construction 7.2 et 10.2 diffèrent l'une de l'autre par deux acides aminés Ala29 ? Ser29 et Ala178 ? Val178. Ces constructions ont été transfectées dans les cellules COS-1. Ces cellules ont alors été incubées durant une période variant de 0-720 minutes avec de la désoxycorticostérone [4-14C]. Les constructions 7.2 et 10.2 ont donné des résultats similaires, soit la transformation de la DOC en corticostérone, 11-déshydrocorticostérone, 18-OH-DOC, 18-OH-corticostérone et 19-OH-DOC mais pas d'aldostérone. Les trois constructions avec le P450c18 ont permis la transformation de la DOC en corticostérone, 11-déhydrocorticostérone, 18-OH-DOC, 18-OH-corticostérone, 19-OH-DOC et aldostérone. La modification de deux acides aminés entre la construction 4.1 et 6.2, leu144 ? Ile144 et Ala326 ? Thr326 démontre une diminution de la formation de l'aldostérone d'environ 29% après 720 minutes d'incubation. Ces résultats indiquent qu’un P450 (P450c11) catalyse les étapes de la formation des glucocorticoïdes et un autre P450 (P450c18) est impliqué dans les dernières étapes de la formation de l'aldostérone dans les surrénales de hamster. Donc les résultats préliminaires suggèrent plusieurs type de P450c11 et P450c18 chez le hamster. De plus la capacité du P450c11 de hamster d'hydroxyler la DOC en position 11? et 19 dans un rapport de 1.32 - 1.15 après 120 minutes d'incubation font de cet animal un excellent modèle pour l’étude de la formation de la 19-OH-DOC, un précurseur de la 19-nor-désoxycorticostérone, un minéralocorticoïde impliqué dans le développement de l'hypertension essentielle.