| dc.description.abstract | Les lignées cellulaires de souris et de rat porteuses du génome intégré du virus du Py peuvent produire des formes virales libres. Ces formes virales intégrées s'excisent suite à une recombinaison intrachromosomique. La lignée CYP est l'une d'elles. La majorité des clones de cette lignée produisent des molécules libres qui correspondent au génome viral normal. Le clone C12/a1 fait pourtant exception en libérant outre du Py, une molécule de taille supérieure appelée RMI. Celle-ci consiste en une chimère composée de 1,03 copies du génome du Py et de 1,6 Kpb. de séquences cellulaires de souris adjacentes au site d'intégration. Le rapport RMI/Py dans le clone C12/a1 est de 20 pour 1. Nous avons élaboré un essai de recombinaison extrachromosomique, afin de recréer les événements qui génèrent ces molécules circulaires libres. Ces essais intramoléculaires ont été effectués avec des vecteurs porteurs de séquences d'ADN génomique du clone C12/a1, potentiellement impliquées dans les mécanismes d'excision qui engendrent les molécules libres trouvées dans le clone C12/a1. Ces vecteurs sont introduits dans des cellules de souris 3T6, par transfection au DEAE-dextran. Après des temps variables d'incubation, l'ADN extrachromosomique est extrait et les formes circulaires libres sont clonées dans des vecteurs phagique et plasmidique. Les recombinants sont identifiés par hybridation in situ à l'aide de sondes spécifiques aux séquences recherchées. La structure même des vecteurs permet une étude comparative des mécanismes de recombinaison homologue, illégitime et site-spécifique en système eucaryotique. Par ailleurs, la production extrachromosomique de la molécule RMI revêt une importance particulière: en effet, celle-ci est le premier exemple de molécule issue d'un événement de recombinaison site-spécifique à partir d'un génome intégré. Habituellement, les molécules libres s'excisent suite à une recombinaison homologue ou illégitime. Par rapport à un essai intrachromosomique, un essai extrachromosomique pouvant produire du RMI faciliterait l'étude du mécanisme de recombinaison site-spécifique. Les essais de recombinaison intramoléculaire, tels que développés, ont permis de produire les formes d'excision homologues et illégitimes. Toutefois, la production de RMI n'a pas été décelée par une telle approche. En fait, aucune molécule de type site-spécifique n'a été identifiée. De même, la recherche de recombinant comportant une jonction site-spécifique s'est avérée infructueuse. De plus, en utilisant un vecteur incapable de recombinaison homologue, mais dont les séquences impliquées dans la recombinaison site-spécifique sont intactes, aucun recombinant ayant une jonction site-spécifique n'est identifié. Par contre, des recombinants illégitimes sont produits. Une étude approfondie des recombinants Py a été effectuée afin de vérifier si la résolution de cette molécule se fait de façon homologue ou spécifique. Les résultats obtenus établissent que la résolution de Py se réalise aléatoirement au niveau des 1541 pb. d'homologie du vecteur, et n'est pas spécifique aux répétitions directes de 182 pb. du virus, inclusent dans cette homologie. En conclusion, l'essai de recombinaison extrachromosomique élaboré a permis de reproduire les mécanismes d'excision de type homologue et illégitime. Cependant, les molécules hypothésées comme étant produites par recombinaison site-spécifique n'ont pu être produites. Ceci pourrait être dû au fait que l'événement est rare, ou encore que notre essai ne permet pas la mise en évidence d'un tel mécanisme. | |
