Recombinaison de la molécule d'ADN hybride RmI à l'aide d'extraits de cellules de souris

Abstract

RmI est une molécule d'ADN résultant de l'excision du génome viral résidant dans une lignée de cellules de souris transformée par un mutant thermosensible du virus du polyome (Py). RmI contient un génome viral complet et une réitération de séquence virale de 182 pb, en plus de 1628 pb d'ADN de souris. Si on introduit par transfection cette molécule dans la cellule de souris, il y a recombinaison entre les répétitions virales pour générer un génome complet de Py. Ce processus requiert, directement ou indirectement, la présence de l'antigène grand T (LT). Dans le but de faire la lumière sur les facteurs nécessaires à cet événement de recombinaison, nous avons tenté de mettre au point un système de recombinaison acellulaire qui nous permette de contrôler et de définir les paramètres impliqués. Nous nous sommes servis d'extraits de cellules de souris non-infectées ou infectées par un vecteur vaccinal recombinant qui véhicule le gène du LT de Py sous la dépendance du promoteur du gène de la thymidine kinase. Le substrat de recombinaison est le plasmide pI-1. Celui-ci contient les séquences de RmI clonées au site Bam HI du plasmide pBR322. La faible quantité de produit formé pendant la réaction n'en permet pas la détection directe. Nous avons donc utilisé la technique dite de PCR ("polymerase chain reaction") pour en augmenter la quantité. Nous avons ainsi réussi à démontrer de la recombinaison survenant dans des conditions où la réplication du substrat n'est pas autorisée. Cette réaction nécessite du Mg2+ et de l'ATP. Elle peut se réaliser en l'absence de la protéine LT puisque son produit est formé grâce à des extraits de cellules non infectées ne contenant aucune protéine spécifique à Py. Le ou les facteurs protéiques impliqués sont d'une grande thermostabilité. Ce système in vitro nous permettra éventuellement d'élucider les mécanismes mis en jeu lors de la recombinaison de l'ADN de Py dans les cellules de souris.