Optimisation des méthodes d'analyse et de séquence manuelle des peptides et leurs applications à la dynorphine immunoréactive isolée de la médullo-surrénale de bœuf

Abstract

Une méthode manuelle de dégradation d'Edman combinée à l'analyse des acides aminés, de leurs dérivés phénylthiohydantoins (PTH) et des dérivés phénylthiocarbamyl-peptides par chromatographie liquide à haute pression (HPLC) est proposée. Tout d'abord, une technique d'analyse d'acides aminés fut développée en faisant réagir les acides aminés avec l'orthophtalaIdéhyde (OPA). Les dérivés fluorescents sont séparés sur une colonne C-18 Résolve (Waters) et détecté avec un fluorimètre, lequel permet d'atteindre une limite de 5 pmol. Chacune des étapes de la dégradation d'Edman fut étudiée soigneusement afin d'optimiser le rendement total de la séquence. La réaction de couplage entre le phénylisothiocyanate (PITC) et le résidu en N-terminal du peptide a lieu dans un tampon de diméthylallylamine (pH 9.5) à 56°C durant 30 min. Les sous-produits de réaction et les excès de réactif sont éliminés avec le 1-chloro-butane, tout en minimisant les pertes de peptide à cette étape. L'utilisation de l'acide chlorhydrique concentré (HCl 12 N) pour cliver l'acide aminé en N-terminal réduit l'accumulation de sels observée avec l'acide trifluoroacétique, ceci nous permet de séquencer un plus grand nombre de résidus dans un peptide. Le thiazolinone est converti en dérivé PTH en présence de HCl 1 N à 80°C durant 10 min. Le PTH-acide aminé est détecté directement par son absorbance dans l'ultraviolet à 254 nm après passage sur HPLC. L'utilisation d'un gradient de métanol:acétonitrile (17:3) dans un tampon d'acétate de sodium 0.02 M (pH 5.4) permet une bonne résolution des PTH-acides aminés sur une colonne Nova Pak (Waters). L'application de ces techniques à la dynorphine immunoréactive isolée de la médullo-surrénale de bœuf confirme la présence des fragments Dyn-(1-11) et -(1-13) à ce niveau.